Nucleic acids as targets and drugs and photolabelling approaches

Activation photochimique de ligands covalents et sélectifs de l'ADN G-quadruplex

Les G-quadruplexes sont des structures non canoniques des acides nucléiques formés au niveau de région riche en guanine et en présence d'ions potassium. Ces structures sont connues pour se former dans le génome humain (> 10 000) et semblent participer à la régulation de phénomènes biologiques.Le but du projet est de développer et étudier des ligands trifonctionnels pour les utiliser comme outils dans un protocole d'immunoprecipitation pour mieux comprendre l'accessibilité et la dynamique des G4s via une association covalente entre le ligand et la structure G4. Les ligands sont composés de i) un coeur PDC qui est capable d'interagir spécifiquement avec les G4s, ii) un groupe photoactivable capable de piéger covalemment les G4s, et iii) un alcyne terminal pour la fonctionnalisation post-piégeage par CuAAC.La première partie présente la synthèse et les études biophysiques et biochimiques des nouvelles familles de ligands G4 photoactivables. La conservation des propriétés du composé PDC vis à vis les G4s a été évalué par des expériences de FRET-melting et G4-FID. Leur capacité a générer une liaison covalente avec la structure G4 a été confirmée par gel d'électrophorèse en condition dénaturante, et les sites d'alkylations ont été identifiés par séquençage chimique et enzymatique.La seconde partie présente les études photochimiques réalisées en présence de prototypes. La nature des espèces réactives a été étudiée par Laser Flash Photolysis. Pour conclure, la photoréactivité a été étudiée en présence de different nucléosides et les adduits produits ont été caracterisés par RMN.

Characterizing G-quadruplex formation : development and integration of novel assays

Les séquences d'acides nucléiques riches en guanines peuvent adopter des structures secondaires non canoniques nommées G-quadruplexes (G4s). Ces structures ont été identifiées dans différents génomes et participent à de nombreux processus physiologiques. De nombreuses séquences G4s putatives (PQS) ont été identifiées par des analyses bioinformatiques et séquençage par immuno-précipitation de la chromatine (ChIP-seq). Par contre, trouver une séquence relativement riche en guanine ne signifie pas forcément qu'elle forme une structure G4. Le but de cette thèse se concentre sur le développement de nouvelles méthodes d'étude in vitro pour la caractérisation de G4s à haut débit, et la validation d'un grand nombre de PQS.Le transfert d'énergie par résonance de type Föster (FRET) est un puissant outil pour le suivi de la dénaturation d'un G4 intramoléculaire fonctionalisé aux extrémités avec deux sondes: un chromophore donneur (FAM) et un accepteur (TAMRA). À faible température, les deux extrémités sont à proximité, permettant la désactivation de la fluorescence du donneur par FRET. Quand la température augmente, le G4 est dénaturé et les deux extrémités s'éloignent, ce qui restaure graduellement la fluorescence du donneur. La température de dénaturation (Tm) peut être obtenue à partir de la courbe de FRET-melting. Une nouvelle méthodologie nommée FRET-melting compétitive (FRET-MC) a été développée, permettant de suivre 48 échantillons en duplica en 2 heures. Le FRET-MC se base sur la compétition d'un ligand sélectif pour les G4s (PhenDC3) entre un G4 reporteur (FAM-Tel21-TAMRA, F21T) et un compétiteur en large excès dont la structure est inconnue. L'interaction du PhenDC3 avec le G4 formé par F21T induit une stabilisation mesurée par l'augmentation du Tm d'environ 23°C. L'excès de compétiteur G4 va piéger le PhenDC3, ramenant le Tm de F21T à la valeur obtenue sans ligand. Une séquence compétitrice qui ne forme pas une structure G4 n'aura pas d'impact sur l'interaction du PhenDC3 avec F21T. Le FRET-MC est une méthode tolérant une grande variabilité de compétiteurs, excepté ceux présentant une faible stabilité thermique, qui se retrouvent sous forme monocaténaire à la température où F21T commence à se dénaturer. Le FRET isotherme (isso-FRET) a été développé comme une alternative compatible avec des G4s peu stables thermiquement. L'iso-FRET exploite deux RNAs : le 37Q (37-quencher) formant un G4 lorsque stabilisé par le PhenDC3, et le F22 (FAM-22) partiellement complémentaire à 37Q. À ce système est ajouté une séquence compétitrice non marquée. Si le compétiteur ne forme pas de G4, le PhenDC3 stabilise 37Q, empêchant son interaction avec F22, ce qui permet un fort signal de fluorescence de F22. Au contraire, un excès de compétiteur formant un G4 piégera le PhenDC3 qui ne sera plus disponible pour stabiliser 37Q. Il en résulte l'hybridation de 37Q avec F22, provoquant la désactivation de la fluorescence de F22. L'iso-FRET peut être utilisé à température 25°C ou physiologique (37°C), ce qui le rend compatible avec les compétiteurs G4s possédants une faible stabilité thermique. En parallèle, la conformation des séquences riches en CG formant des G4s a été réalisée. La structure des séquences riches en GC est étroitement liée au nombre de cytosines, mais également au ratio de [K⁺] / [Na⁺] présent dans le tampon. Les résultats spectroscopiques montrent que CEB25 tolère des boucles continues de cytosines dans un tampon mixte potassium / sodium. Cela implique que les séquences G4s riches en cytosine peuvent toujours adopter une structure G4 dans l'environnement intracellulaire. Les résultats d'UV-melting mettent en évidence que la présence de cytosines dans les boucles G4 ne diminuent pas leur stabilité, mais augmente la probabilité de former une tige-boucle ou un ADN palindromique bicaténaire en compétition. L'emplacement des PQS riches en cytosines a été étudié par analyse bioinformatique et indique une localisation au niveau des pré-ARNm.

Novel functional G-quadruplex ligands for cell imaging and genomic DNA covalent capture

G-quadruplexes (G4s) are non-canonical secondary structures that can be formed in G-rich DNA or RNA strands containing at least four repeats of two guanines. Today, these structures are known to regulate important biological processes such as replication, transcription and translation. Since their discovery, many small molecules (called G4 ligands) have been developed in the aim to selectively interact with these structures. However, G4 dynamic nature makes them difficult to study in cellular conditions. Therefore, it is still necessary to develop new molecular tools to study them in live cells. In this context, a new methodology called G4-GIS has been developed. This methodology allows to follow with higher resolution the localization of small molecules in cells and combines the advantages of using G4 ligands and immunofluorescence. For the development of this project, several derivatives of the known G-quadruplex ligand PDC were functionalized with a hapten (5-BrdU), which can be recognized by a specific antibody. At first, the synthesis focused on the functionalization of the PDC core with a linker bearing either an azide or an alkyne (PDC-Alk/N3). In parallel, the commercially available 5-BrdU was functionalized with an azide or alkyne group (5-BrdU-Alk/N3). The different PDC ligands were then tethered to the adapted 5-BrdU-Alk/N3 partners by a CuAAC reaction to form the 5BrdU functionalized PDC derivatives. This reaction can be performed in the presence of the G4 target (in situ functionalization), avoiding potential loss of affinity or selectivity due to the presence of the hapten. The different PDC derivatives, before and after functionalization, were then evaluated for their ability to bind G-quadruplex structures by two biophysical assays. Cell imaging of PDC-BrdU ligands was then performed by immunofluorescence staining. In addition, this method was performed after in situ functionalization of PDC-Alk/N3 ligands with 5-BrdU moiety. This G-quadruplex ligand immunodetection methodology allows to visualize with an excellent resolution the precise localization of G-quadruplex ligands in cells. Determining the exact localization of G-quadruplex structures throughout the genome is a major challenge for unravelling the biological roles of G-quadruplexes. For this purpose, a new method combining G4 photoaffinity labeling (PAL) and immunoprecipitation capture has been developed. PDC derivatives functionalized with both a photoactivatable moiety and a terminal alkyne were synthesized. The affinity and selectivity of these ligands towards G-quadruplex structures have been evaluated by two biophysical methods and the ability to selectively generate covalent bonds with G-quadruplex DNA after photo-irradiation was studied on different G4-forming sequences. In the next future, these G4 ligands will be employed in cells and, after immuno-tag (5BrdU) functionalization by CuAAC reaction, will be used to develop a chemical immunoprecipitation methodology. By using this approach, it will be possible to understand which G4s are really forming in a dynamic system and their accessibility by the ligands in order to clarify their roles associated with biological functions such as transcription.